一种太赫兹生物传感器及其制备方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111781158 A(43)申请公布日 2020.10.16

(21)申请号 202010391973.8(22)申请日 2020.05.11

(71)申请人 韶关学院

地址 512005 广东省韶关市浈江区大学路

288号(72)发明人 刘建军　范兰兰　李铁军　邵桂芳　(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569

代理人 瞿晓晶(51)Int.Cl.

G01N 21/3586(2014.01)G01N 21/03(2006.01)B01L 3/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书10页 附图5页

CN 111781158 A(54)发明名称

一种太赫兹生物传感器及其制备方法和应用

(57)摘要

本发明提供了一种太赫兹生物传感器及其制备方法和应用，属于太赫兹生物传感器技术领域，所述太赫兹生物传感器，包括太赫兹差分微流盘通道；所述太赫兹差分微流盘通道包括依次连通的入口通道、第一微流盘、第二微流盘和出口通道；所述第一微流盘和第二微流盘通过微通道连接；所述太赫兹差分微流盘通道以石英玻璃为基底，以聚合物PDMS为盖膜；所述石英玻璃表面接枝具有温度敏感硼酸亲和效应的P(NIPAAm‑co‑VPBA)聚合物。所述太赫兹生物传感器将太赫兹特性与微流控技术相结合，实现对顺式二羟基生物分子高灵敏度的分离和检测。

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权　利　要　求　书

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1.一种太赫兹生物传感器，其特征在于，包括太赫兹差分微流盘通道；所述太赫兹差分微流盘通道包括依次连通的入口通道、第一微流盘、第二微流盘和出口通道；所述第一微流盘和第二微流盘通过微通道连接；

所述太赫兹差分微流盘通道以石英玻璃为基底，以聚合物PDMS为盖膜；所述石英玻璃表面接枝具有温度敏感硼酸亲和效应的P(NIPAAm-co-VPBA)聚合物。

2.根据权利要求1所述的太赫兹生物传感器，其特征在于，所述太赫兹差分微流盘通道的深度为40～60μm；

所述第一微流盘和第二微流盘之间的间距为20～40μm；所述微通道的宽度为10～100μm。

3.根据权利要求1所述的太赫兹生物传感器，其特征在于，所述太赫兹差分微流盘通道内壁设置有BSA涂层，所述BSA涂层用的涂层剂中BAS的浓度为1～2mg/mL；所述涂层剂的pH值为4.0～5.0。

4.权利要求1～3任意一项所述的太赫兹生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)通过SI-ATRP反应在石英玻璃基底表面接枝P(NIPAAm-co-VPBA)获得温度敏感硼酸亲和玻璃基片；

2)将带有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜与SU-8光胶在UV的作用下进行光刻固化、冲洗获得带有光胶层的掩膜；

3)将所述带有光胶层的掩膜和温度敏感硼酸亲和玻璃基片进行键合后，去掩膜获得太赫兹差分微流盘通道的基底；

4)将所述太赫兹差分微流盘通道的基底与SU-8光胶盖片键合获得太赫兹差分微流盘通道；所述SU-8光胶盖片带有入口通道和出口通道。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：将所述涂层剂注入到所述太赫兹差分微流盘通道内进行涂层后静置的步骤，所述静置的时间为5～10h。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述光刻固化的时间为30～35s。7.权利要求1～3所述的太赫兹生物传感器在顺式二羟基生物分子的分离、检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述顺式二羟基生物分子包括蛋白质和核酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述蛋白质包括转基因BT蛋白。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将待检测样品通过太赫兹生物传感器，在4～55℃实现目标物的捕获，在＜4℃实现目标物的释放；

在0.3～1.1THz的频段范围内用太赫兹时域光谱技术进行表征，根据表征结果确定目标物的种类；

将第一微流盘和第二微流盘测得的太赫兹光谱响应求差获得最终的太赫兹光谱响应值。

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一种太赫兹生物传感器及其制备方法和应用

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技术领域

[0001]本发明属于太赫兹生物传感器技术领域，尤其涉及一种太赫兹生物传感 器及其制备方法和应用。

背景技术

[0002]随着基因工程技术的发展，人类可以在生物体中植入外源基因，使物种 在保留本身特性的同时也具备其它新的特性，如：抗虫性、抗逆性等。然而 这些转基因物种对人类健康、生态环境、伦理道德等会带来潜在的威胁，因 此需要对转基因生物进行检测和鉴别。转基因物质具有种类多、成分复杂以 及转基因含量低等特点，实现对转基因生物样品中目标蛋白质的高灵敏快速 检测是后续研究的基础。目前，常用的检测方法会在一定程度上破坏蛋白质 或基因片段，且费时费力、程序复杂、成本较高，非专业人员难以胜任，不 适用于基因和蛋白质的高灵敏度实时在线检测。[0003]研究发现，很多生物大分子(如蛋白质或DNA)的特征振动模式恰好 位于太赫兹频段内，这使得太赫兹成为一种有潜力的生物化学传感工具。但 是水对太赫兹辐射具有极强的吸收性，这使得研究液体样品的太赫兹透射谱 变得相对很难。因此，有必要寻求一种能够缩短液体样本与太赫兹作用长度 的方法，降低水对太赫兹辐射的强烈吸收。[0004]微流体技术已经被列入21世纪最重要的前沿技术行列。微流体技术作 为一种极具潜力的分析平台，可以与实验室中所用到的生物技术或分析方法 进行集成，使用微流体技术可将液体厚度准确控制在100μm之内，不仅可 以降低样品的消耗量、缩短分析时间，而且可以提高检测的灵敏度、实现样 品的高通量检测。因此，太赫兹与微流体技术相结合将成为研究生物传感特 性中一个很有趣的方向。

[0005]但是检测过程中样品中的水对太赫兹辐射的吸收较为强烈，太赫兹光谱 检测中存在非传感漂移干扰容易引起检测误差；无法实现蛋白质的高灵敏度 检测。发明内容

[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种太赫兹生物传感器及其制备方法 和应用。[0007]在本发明中，所述太赫兹生物传感器将太赫兹特性与微流控技术相结 合，通过在石英玻璃作为基板的微流控芯片上进行差分微流盘通道结构的传 感设计，消除在太赫兹光谱检测中非传感漂移干扰所引起的误差。[0008]进一步的，通过在微流通道中引入牛血清白(BSA)涂层，来避免微流 通道内壁对分析物中目标蛋白的吸附，从而最大限度的降低微流通道内壁对 生物样品产生的非特异性吸附，实现微流通道内壁修饰的再生性。[0009]进一步的，利用原位表面原子转移自由基聚合(SI-ATRP)反应，在玻 璃微流盘通道中接枝具有温度敏感硼酸亲和效应的P(NIPAAm-co-VPBA)聚 合物，通过温度调节控制P链亲水和疏水状态，实现目标蛋白的富集与释放， 并利用太赫兹时域光谱技术(THz-TDS)进行表征，实现蛋白质的实时、高 通量、高灵敏度检测。

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本发明提供了一种太赫兹生物传感器，包括太赫兹差分微流盘通道；所 述太赫兹

差分微流盘通道包括依次连通的入口通道、第一微流盘、第二微流 盘和出口通道；所述第一微流盘和第二微流盘通过微通道连接；

[0011]所述太赫兹差分微流盘通道以石英玻璃为基底，以聚合物PDMS为盖 膜；所述石英玻璃表面接枝具有温度敏感硼酸亲和效应的 P(NIPAAm-co-VPBA)聚合物。[0012]优选的，所述太赫兹差分微流盘通道的深度为40～60μm。[0013]优选的，所述第一微流盘和第二微流盘之间的间距为20～40μm。[0014]优选的，所述微通道的宽度为10～100μm。[0015]优选的，所述太赫兹差分微流盘通道内壁设置有BSA涂层。[0016]优选的，所述BSA涂层用的涂层剂中BAS的浓度为1～2mg/mL；所述 涂层剂的pH值为4.0～5.0。

[0017]本发明还提供了所述的太赫兹生物传感器的制备方法，包括以下步骤：[0018]1)通过SI-ATRP反应在石英玻璃基底表面接枝P(NIPAAm-co-VPBA) 获得温度敏感硼酸亲和玻璃基片；

[0019]2)将带有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜与SU-8光胶在UV的作用下 进行光刻固化、冲洗获得带有光胶层的掩膜；

[0020]3)将所述带有光胶层的掩膜和温度敏感硼酸亲和玻璃基片进行键合后， 去掩膜获得太赫兹差分微流盘通道的基底；

[0021]4)将所述太赫兹差分微流盘通道的基底与SU-8光胶盖片键合获得太赫 兹差分微流盘通道；所述SU-8光胶盖片带有入口通道和出口通道。[0022]优选的，还包括：将所述涂层剂注入到所述太赫兹差分微流盘通道内进 行涂层后静置的步骤。[0023]优选的，所述静置的时间为5～10h。[0024]优选的，所述光刻固化的时间为30～35s。

[0025]本发明还提供了所述的太赫兹生物传感器在顺式二羟基生物分子的分 离、检测中的应用。

[0026]优选的，所述顺式二羟基生物分子包括蛋白质和核酸。[0027]优选的，所述蛋白质包括转基因BT蛋白。[0028]优选的，将待检测样品通过太赫兹生物传感器，在4～55℃实现目标物的 捕获，在＜4℃实现目标物的释放。[0029]优选的，在0.3～1.1THz的频段范围内用太赫兹时域光谱技术进行表征， 根据表征结果确定目标物的种类。[0030]优选的，将第一微流盘和第二微流盘测得的太赫兹光谱响应求差获得最 终的太赫兹光谱响应值。

[0031]本发明的有益效果：本发明提供的太赫兹生物传感器将太赫兹特性与微 流控技术相结合，实现对顺式二羟基生物分子高灵敏度的分离和检测。

[0032]本发明从太赫兹和微流体两个层面分析顺式二羟基生物分子检测结果 不稳定性的来源，建立了抑制水对太赫兹强烈吸收及消除非传感漂移干扰的 方法。目前关于太赫兹检测顺式二羟基生物分子的研究大多局限于提高处理 准确率的算法设计或改进，而对影

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响检测结果的因素关注甚少。本发明从对 检测结果的影响和评价两个角度入手，区别于以往生物检测方法，从太赫兹 和微流体两个层面开展研究，结合各自特点，通过在石英玻璃作为基底的微 流控芯片上进行差分微流盘通道结构的传感设计，抑制水对太赫兹强烈吸 收、消除在太赫兹光谱检测中非传感漂移干扰所引起的误差，提高检测结果 的稳定性。[0033]本发明从减小蛋白质与微流盘通道内壁的相互作用出发，对微流盘通道 内壁进行BSA涂层，抑制微流盘通道内壁对生物分子的非特异性吸附。通 常生物分子，例如蛋白质，很容易被吸附到微流盘通道内壁表面，这种吸附 会导致差的峰形、不可重现的迁移时间和无规则的电渗流(EOF)。因此， 基于太赫兹差分微流盘的检测中的一个主要任务就是减小待检测物质与微 流盘通道内壁的相互作用。为了避免在微流盘通道中直接进行涂层的弊端， 本发明提供了一种简单、快速、有效的微流盘通道涂层方法—BSA涂层， BSA涂层可以最大限度的降低微流盘通道内壁对蛋白样品产生的非特异性 吸附。[0034]本发明从提高目标蛋白的相对浓度出发，提供了基于温度敏感硼酸效应 的目标蛋白捕获与释放方法。如何从种类繁多、成分复杂且含量较低的生物 样品中实现目标蛋白的高灵敏快速检测，一直以来都是分析工作者所追求并 致力解决的科学问题之一。因此，实现低浓度目标蛋白的锁定具有现实意义。 本发明在检测前对样品进行预处理，提高目标物的浓度，从混合物中将目标 物纯化、分离出来。本发明利用原位表面原子转移自由基聚合(SI-ATRP) 反应，在太赫兹微流盘通道中接枝P(NIPAAm-co-VPBA)聚合物，通过温度 调节控制P(NIPAAm-co-VPBA)链亲水和疏水状态，从而实现目标蛋白的捕 获与释放。附图说明

[0035]图1为转基因太赫兹生物传感器的总体设计框图；[0036]图2为差分微流通道原型示意图(非比例)，其中左图为俯视图， 右图为截面图；[0037]图3为水在0.3THz～1.1THz频段的吸收系数(灰色线)和折射率(黑 色线)；[0038]图4为内壁修饰BSA涂层的玻璃微流控芯片对蛋白质的分离效果图；[0039]图5为通过SI-ATRP反应在石英玻璃基片表面接枝P(NIPAAm-co-VPBA) 的原理图；[0040]图6为温度敏感硼酸亲和效应微流盘通道制备流程图；

[0041]图7为温度敏感硼酸亲和效应的微流盘通道目标捕获和目标释放的原 理图；[0042]图8为不同温度下P接枝的玻璃基片表面接触角的测量，其中(a)4℃, (b)25℃,(c)55℃；

[0043]图9为实施例中获得的三个棉种的THz频域光谱图。

具体实施方式

[0044]本发明提供了一种太赫兹生物传感器，包括太赫兹差分微流盘通道；所 述太赫兹差分微流盘通道包括依次连通的入口通道、第一微流盘、第二微流 盘和出口通道；所述第一微流盘和第二微流盘通过微通道连接；所述太赫兹 差分微流盘通道以石英玻璃为基底，以聚合物PDMS为盖膜；所述石英玻璃 表面接枝具有温度敏感硼酸亲和效应的P(NIPAAm-co-VPBA)聚合物。

[0045]在本发明中，所述太赫兹差分微流盘通道的结构如图2所示；在本发明 中，所述太赫兹差分微流盘通道的深度优选为40～60μm，更优选为45～55μm； 所述太赫兹差分微流盘

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通道的深度设置为上述范围，是为了控制液体样本与 太赫兹作用长度。在本发明中，所述第一微流盘和第二微流盘之间的间距优 选为20～40μm，更优选为25～35μm，当所述第一微流盘和第二微流盘之间的 间距在上述范围内时，能够有效消除非传感漂移干扰。在本发明中，所述微 通道的宽度优选为10～100μm，所述微通道宽度可以根据被检测生物分子的 大小和液体样品的量进行调整。[0046]在本发明中，所述太赫兹差分微流盘通道内壁优选的设置有BSA涂层。 在本发明中，所述BSA涂层用的涂层剂中BAS的浓度优选为1～2mg/mL， 更优选为1.6mg/mL；所述涂层剂的pH值优选为4.0～5.0，更优选为4.3；所 述涂层剂的溶剂优选为磷酸盐缓冲液(PB)，本发明以RNase A为分离对 象，在BSA涂层浓度剂中BAS的浓度为1.6mg/mL，涂层剂的pH值为4.3 的条件下，RNase A的理论塔板数达到1.28×105，理论塔板数最高。[0047]本发明还提供了所述的太赫兹生物传感器的制备方法，包括以下步骤： 1)通过SI-ATRP反应在石英玻璃基底表面接枝P(NIPAAm-co-VPBA)获得温 度敏感硼酸亲和玻璃基片；2)将带有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜与SU-8 光胶在UV的作用下进行光刻固化、冲洗获得带有光胶层的掩膜；3)将所 述带有光胶层的掩膜和温度敏感硼酸亲和玻璃基片进行键合后，去掩膜获得 太赫兹差分微流盘通道的基底；4)将所述太赫兹差分微流盘通道的基底与 SU-8光胶盖片键合获得太赫兹差分微流盘通道；所述SU-8光胶盖片带有入 口通道和出口通道。

[0048]在本发明中，通过SI-ATRP反应在石英玻璃基底表面接枝 P(NIPAAm-co-VPBA)获得温度敏感硼酸亲和玻璃基片。在本发明中，所述 SI-ATRP反应的原理图如图5所示；本发明在UV诱导下利用原位表面原子 转移自由基聚合(SI-ATRP)反应，在石英玻璃基底和微流盘通道中接枝P 聚合物，具体过程包括以下步骤：[0049](1)将石英玻璃基片浸泡在包括苯甲酮的丙酮溶液1小时后，用去离 子水冲洗；[0050](2)将接枝混合液滴加在石英玻璃基片上进行UV光照射接枝，待UV 接枝聚合反应完成后，依次丙酮和水冲洗获得温度敏感硼酸亲和玻璃基片。[0051]在本发明中，所述包括苯甲酮的丙酮溶液中苯甲酮的体积百分含量优选 为20％；所述去离子水冲洗优选的用充足的去离子水进行快速冲洗。在本发 明中，所述接枝混合液优选的包括以下组分：10％(w/v)NIPAAm，8.44 mgPBA(所述NIPAAm和PBA的摩尔比为10:1)和0.5mM NaIO4和 0.5％(w/v)的苯甲醇。在本发明中，所述接枝混合液的滴加体积优选为 150～250μL，更优选为200μL。在本发明中，滴加了接枝混合液的石英玻璃 基片优选的放置于冰上，以散掉紫外UV照射引发反应进行过程中产生的热 量。在本发明中，所述UV光照射接枝优选的通过光刻机上的UV光照射实 现；所述UV光照射接枝的时间优选为30～35s，更优选为32s。本发明待UV 接枝聚合反应完成后，依次用大量的丙酮和水充分冲洗石英基片。[0052]在本发明中，将带有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜与SU-8光胶在UV 的作用下进行光刻固化、冲洗获得带有光胶层的掩膜。在本发明中，所述带 有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜的材质优选为石英，所述浮雕掩膜优选的 采用正胶工艺制作，所述浮雕掩膜优选的委托掩膜版制作公司来完成。在本 发明具体实施过程中，首先在铬板上固定掩膜框，将脱气后的SU-8光胶铺 展在掩膜框内；然后将带有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜放置于掩膜框内 的SU-8光胶上进行光刻固化。在本发明中，优选的避免浮雕掩膜与SU-8 光胶之间形成气泡；所述光刻固化的时间优选为30～35s，更优选为32s。本 发明在所述光刻固

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化结束后优选的将所述掩膜与固化的光胶从铬板上撕下， 进行冲洗，所述冲洗优选的使用光胶清洗液进行，所述冲洗结束后，优选的 用吹风机吹干，所述冲洗优选的重复两次。[0053]在本发明中，将所述带有光胶层的掩膜和温度敏感硼酸亲和玻璃基片进 行键合后，去掩膜获得太赫兹差分微流盘通道的基底。在本发明中，所述键 合压力优选为8.64N，所述键合的键合头温度优选为280℃，所述键合的玻 璃基板温度优选为100℃。本发明在所述键合后，优选的使用光胶枪进行封 边，将上层的掩膜撕下，获得太赫兹差分微流盘通道的基底。

[0054]在本发明中，将所述太赫兹差分微流盘通道的基底与SU-8光胶盖片键 合获得太赫兹差分微流盘通道。在本发明中，所述SU-8光胶盖片优选的带 有入口通道和出口通道；所述SU-8光胶盖片的制备方法与所述太赫兹差分 微流盘通道的基底的制备方法类似，见图6中的右侧图示，在此不再赘述。 在本发明中，所述键合压力优选为8.64N，所述键合的键合头温度优选为 280℃，所述键合的玻璃基板温度优选为100℃。[0055]本发明在获得所述太赫兹差分微流盘通道后，优选的还包括：将所述涂 层剂注入到所述太赫兹差分微流盘通道内进行涂层后静置的步骤。在本发明 中，所述静置的时间优选为5～10h。在本发明中，所述涂层剂的注入优选的 采用蠕动泵进行。

[0056]本发明还提供了所述的太赫兹生物传感器在顺式二羟基生物分子的分 离、检测中的应用。

[0057]在本发明中，所述顺式二羟基生物分子优选的包括蛋白质和核酸；所述 蛋白质优选的包括转基因BT蛋白。[0058]在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：将待检测样品通过太赫兹 生物传感器，在4～55℃实现目标物的捕获，在＜4℃实现目标物的释放。本 发明通过温度调节实现目标物的捕获与释放，能够富集和分离待检测样本中 的目标物；目标物释放后能够实现对目标物的检测。在本发明中，优选的在 0.3～1.1THz的频段范围内用太赫兹时域光谱技术进行表征，根据表征结果 确定目标物的种类。在本发明中，优选的将第一微流盘和第二微流盘测得的 太赫兹光谱响应求差获得最终的太赫兹光谱响应值。

[0059]下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。[0060]实施例1

[0061]一种太赫兹生物传感器，包括太赫兹差分微流盘通道；所述太赫兹差分 微流盘通道包括依次连通的入口通道、第一微流盘、第二微流盘和出口通道； 所述第一微流盘和第二微流盘通过微通道连接；所述太赫兹差分微流盘通道 以石英玻璃为基底，以聚合物PDMS为盖膜；所述石英玻璃表面接枝具有温 度敏感硼酸亲和效应的P(NIPAAm-co-VPBA)聚合物。

[0062]所述太赫兹差分微流盘通道的结构如图2所示；在本发明中，所述太赫 兹差分微流盘通道的深度优选为50μm，第一微流盘和第二微流盘之间的间 距优选为30μm，所述微通道的宽度优选为50μm，所述微通道宽度可以根据 被检测生物分子的大小和液体样品的量进行调整。太赫兹差分微流盘通道内 壁设置有BSA涂层。BSA涂层用的涂层剂中BAS的浓度为1.6mg/mL；涂 层剂的pH值为4.3；所述涂层剂的溶剂为磷酸盐缓冲液(PB)，本发明以 RNase A为分离对象，在BSA涂层浓度剂中BAS的浓度为1.6mg/mL，涂层 剂的pH值为4.3的条

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件下，RNase A的理论塔板数达到1.28×105，理论塔板 数最高。[0063]制备方法：

[0064]本发明利用有限元分析方法设置微流盘通道参数及边界条件并在COMSOL Multiphysics平台下初步建立一个差分微流盘通道。本发明选用吸 收率较低的石英玻璃作为基底，选取易于粘附、易于制作的聚合物PDMS 作为盖膜。

[0065]本发明采用富集分离技术在检测前对样品进行预处理，从混合物中将目 标物纯化、分离出来。本发明采用富集分离技术在检测前对样品进行预处理， 从混合物中将目标物纯化、分离出来。聚N-异丙基丙烯酰胺 (Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAAm)与苯硼酸(PBA)形成的热响应 聚合物P(NIPAAM-co-PBA)，随着温度的变化，其聚合物链具有亲水和疏水 性能的变化，表现为聚合物链的伸展和卷曲，可以实现对含有顺式二羟基的 生物分子的捕获与释放。在UV诱导下利用原位表面原子转移自由基聚合 (SI-ATRP)反应，在石英玻璃基底和微流盘通道中接枝P聚合物，其原理 如图5所示。其中石英玻璃基底的接枝具体过程如下(微流盘通道中接枝方 法类似)：[0066](1)首先，将石英玻璃基片浸泡在含有20％苯甲酮的丙酮溶液中，一 定时间后用充足的去离子水快速冲洗；[0067](2)制备1mL混合液，此混合液中含有10％(w/v)NIPAAm，8.44 mgPBA(NIPAAm和PBA的摩尔比为10:1)，0.5mM NaIO4和0.5％苯甲醇 (w/v)；[0068](3)吸取200μL此混合液，滴加在石英玻璃基片表面上的中央位置， 将此石英基片放在装满冰的塑料盒上，以散掉紫外(UV)照射引发反应进 行过程中产生的热量；[0069](4)用光刻机上的UV光照射石英基片；[0070](5)待UV接枝聚合反应完成后，依次用大量的丙酮和水充分冲洗石 英基片。[0071]具有温度敏感硼酸亲和效应的微流盘通道的具体制备过程如图6所示。 首先，在PDMS上制作微流通道的浮雕掩膜和盖片掩膜(只含输入输出口) 以及接枝P聚合物的玻璃基片，然后用其构建微流控微芯片。微流控芯片的 构建方法如下：[0072](1)在铬板上固定掩膜框；[0073](2)用注射器吸取400μL的脱气后的SU-8光胶，将其轻轻铺展在掩膜 框内；[0074](3)将带有差分微流盘通道结构的浮雕掩膜轻轻放置于掩膜框内的 SU-8光胶上面，并且不能在掩膜与SU-8光胶之间形成气泡；[0075](4)将此铬板放置于光刻机下进行光刻固化32s，只有掩膜通道的地 方没有被固化；[0076](5)轻轻将掩膜与固化的光胶层从铬板上撕下，快速用光胶清洗液进 行冲洗掩膜上的固化的光胶层，吹风机吹干，重复两次；[0077](6)将此光胶层快速与上述制备好的温度敏感硼酸亲和玻璃基片进行 键合，接着用光胶枪进行封边，待键合牢固后，将上层的掩膜片撕下；[0078](7)利用相同的方法制备光胶层通道的盖片，这个盖片是只含有入口 和出口的SU-8基片；[0079](8)将此盖片与玻璃基片上键合的的SU-8基片进行键合，制备获得差 分微流盘温度敏感硼酸亲和微流控芯片。

[0080]太赫兹差分微流盘通道的内壁涂层及稳定性评价

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(1)太赫兹差分微流盘通道内壁涂层

[0082]在转基因物质检测中，蛋白质特别是转基因蛋白，很容易被吸附到微流 盘通道内壁表面。这种吸附主要来源于蛋白与微流盘通道内壁静电作用。研 究发现蛋白质非特异性吸附会导致差的峰形、不可重现的迁移时间和无规则 的电渗流(EOF)，从而导致基因表达谱数据不可靠，造成基因表达数据分 析结果无法解读或无意义。为此，本发明引入BSA涂层对微流盘通道内壁 进行修饰，并对其进行表征，选用化学上常用的含有核糖核酸酶(RNase A) 与二甲基亚砜(DMSO)的混合液作为分析物，对涂层进行优化评价，并采 用RNase A色谱峰的峰形和理论塔板数以及DMSO的迁移时间来评价涂层 毛细管的效能。理论塔板数公式：

[0083]

[0084][0085]

其中，是RNase A的迁移时间(min)；W1/2是半峰宽(cm)。

由于石英玻璃微流控芯片的制备比较繁琐并且制备时间长，与相同材质 的毛细管相比较，价格也相对昂贵，因此直接在微流控芯片中反复进行涂层 和表征这样会造成微流控芯片的浪费，并且费时费力。另外，对于涂层后的 微流控芯片进行表征时，通常是对FITC(异硫氰酸荧光素)标记的蛋白质 进行电泳，这样就需要对蛋白质进行荧光标记，而荧光标记又会消耗更多的 时间，也会消耗更多的试剂。由于毛细管和玻璃芯片的材质是相同的，对毛 细管内壁进行涂层和对芯片通道进行涂层，涂层后的封闭效果，原理上是相 同的。并且毛细管电泳所用的毛细管电泳仪是UV检测器，可以直接进行自 动化电泳以表征涂层效果。为了避免上述直接在微流控芯片中直接进行涂层 的弊端，本发明先在毛细管内壁进行采用蠕动泵冲洗的方式进行BSA涂层， 然后静置一定时间后对其进行表征，最后找到最佳的涂层条件，并将其应用 于微流控芯片中。图4为玻璃微流控芯片经BSA涂层内壁修饰后，实现了 过氧化氢酶和碳酸酐酶两种标准蛋白混合物的分离。[0086]在优化过程中，需要考察涂层缓冲液的pH值，涂层的静置时间以及BSA 的涂层浓度，确定最佳的涂层缓冲液pH和涂层BSA浓度，并将其应用于微 流盘通道中以达到减小蛋白质与微流控芯片内壁的相互作用，避免微流盘通 道内壁对分析物中目标蛋白的吸附的目的。由于BSA的等电点(pI)为4.7， 因此选择pH值为4.0～7.0范围的缓冲液作为涂层缓冲液的pH值，分别制备 带有正电荷和负电荷的BSA涂层缓冲液，BSA涂层缓冲液为磷酸盐缓冲液 PB。与此同时，制备一系列不同浓度的BSA涂层溶液，浓度分别为： 0.2mg/mL、0.70mg/mL、1.6mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL。 对BSA涂层的毛细管进行毛细管电泳(CE)实验验证。

[0087]通过实验验证，获得结果如下：[0088]a)经过色谱峰的峰形验证，在涂层缓冲液pH为4.3的条件下，RNase A峰和DMSO峰已经被完全分离，并且在所有不同BSA涂层浓度下的 RNaseA的峰形最好，因此选取涂层的最佳缓冲液的pH值为4.3。[0089]b)通过理论塔板数计算，在BSA涂层浓度为1.6mg/mL，以及最佳的涂 层缓冲液pH值为4.3的条件下，RNase A的理论塔板数达到最高1.28×105。 因此，采用BSA涂层的最佳浓度是1.6mg/mL。

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c)在涂层缓冲液最佳pH值为4.3以及BSA涂层的最佳浓度为1.6mg/mL 的条件下，

进行了涂层静置时间的优化。利用三根相同的毛细管，涂层的静 置时间分别为3h、5h、10h和12h，其余的制备条件均相同的条件下进行BSA 涂层。以RNase A和DMSO的混合物作为CE的分析对象，利用CE所得结 果来考察这三根BSA涂层的毛细管的性能。当涂层静置时间为2h，RNase A的理论塔板数仅有8500N/m；当静置时间增加到5h，RNase A的理论塔 板数增加到9.4×104N/m；当静置时间延长到10h，RNase A的理论塔板数增 加到1.0×105N/m；当静置时间延长到12h，RNase A的理论塔板数增加到 1.02×105N/m当静置时间从3h增加到5h，RNase A的理论塔板数增加了近 12倍，这表明要形成好的BSA涂层，3h的静置时间是远远不够的；但当静 置时间从5h增加到10h和12h时，虽然经过了一个长的静置时间间隔，但 是理论塔板数增加的却很少，这就说明BSA涂层静置时间为10h，涂层已 经达到了一个很好的吸附状态。因此最终确定的BSA涂层的最佳静置时间 为10h。[0091](2)差分微流盘通道内壁涂层的稳定性评价[0092]转基因蛋白高灵敏检测具有分级特性，即前面处理结果是后面的基础， 为消除误差累积效应，确定BSA涂层是否满足实验要求，必须对微流盘通 道内壁涂层的稳定性进行评价。本发明采用电渗流(EOF)和RNase A的理 论塔板数来评价。EOF的计算公式：

[0093]

[0094]其中，是DMSO的迁移时间，是太赫兹微流盘通道内壁直径长度 (cm)，是

太赫兹微流盘通道总长度(cm)，是分离电压(V)。用涂层的微流 盘通道连续电泳48h，每12h作为一个间隔，记录电渗流(EOF)和RNase A 的理论塔板数。[0095]根据记录数据分别计算电渗流(EOF)和RNase A的理论塔板数的相对 标准偏差RSD。只有RSD低于某个特定值(例如10％)，才能证明微流盘 通道内壁涂层具有较高的稳定性。实验结果见表所示。从表1可以看到， 起始阶段，涂层毛细管的EOF是2.56±0.04(×10-4

cm2/V/s)，RNase A的理 论塔板数为1.34±0.03(×105)；当用此涂层毛细管连续电泳48h后，EOF变 为2.65±0.04(×10-4cm2/V/s)，RNase A的理论塔板数变为1.25±1.61(× 105)。另外，连续电泳48h后，EOF和理论塔板数的RSD值分别为4.14％ 和9.14％。这些结果足以证明涂层具有一个高的稳定性。[0096]表1涂层毛细管的EOF和RNase A的理论塔板数

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选取合适的工作频段

[0099]保持高信噪实现转基因目标蛋白的太赫兹特征光谱的提取，对选择有效 的处理方法及提升处理精度具有重要意义。因此有必要对太赫兹差分微流盘 通道的工作频段进行筛选，防止其他因素干扰特征光谱的提取。通过优化双 盘间的间距，双盘在一定频率范围内发生耦合，而两个盘发生重合的谐振频 率个数是唯一的，根据分析，只有谐振频率重合才能满足消除非传感漂移干 扰的条件。当选择一个合适盘间距，双盘的谐振频率将发生重合，使得传感 工作频率能被单独筛选出来进行观察。本发明以太赫兹时域光谱系统作为测 量平台，采用传输线理论计算微流盘通道的谐振频率，并绘出频率响应特征 曲线。为了检测太赫兹生物传感器的可用性，在使用其测量生物化学液体样 品前，对在生物和化学活动中扮演非常重要角色的液体-水，进行了太赫兹 频段的测量。实验结果显示水在0.3～1.1THz范围内的吸收系数和折射率曲 线与使用不同材质制作的液体样品池所测量的结果有较好的一致性，如图3 所示。工作频段选择在0.3～1.1THz，这个频段对于水没有明显的吸收峰， 太赫兹波的透过率较高(50％以上，最高时为85％)。因此选取该频段作为 本发明太赫兹传感器的有效频率范围。[0100]目标蛋白质的捕获与释放

[0101]本发明通过调节温度实现顺式二羟基生物分子腺苷的捕获与释放，原理 如图7所示。当温度低于最低共溶温度(Lower Critical Solution Temperature， LCST)时，接枝的P(NIPAAm-co-VPBA)聚合物处于亲水状态，P链伸展开， 这样就会暴露链上目标物的结合位点硼酸根基团，当样品中含有顺式二羟基 的目标物时，就会捕获其中的带有顺势二羟基的生物分子；当升高温度并且 温度高于LCST时，接枝的聚合物处于疏水状态，P链由伸展变为卷曲，同 时被捕获的顺式二羟基的生物分子脱落下来。这样就通过调节温度实现顺式 二羟基生物分子腺苷的捕获与释放。P聚合物的亲水和疏水性能(浸润性)， 可以通过测量液体在固体上的接触角来间接表征，不同温度下液体在温度敏 感硼酸亲和玻璃基板的接触角如图8所示。从图8中可以观察到，当基片的 温度维持在4℃时，测得的接触角是30.6度；当温度升高到25℃时，水的接 触角增加为53.1度，这表明当温度从4℃升高到25℃时，其表面的亲水性降 低；当温度升高到55℃时，这时P接枝的玻璃基片的接触角迅速升高到93.3 度。表明当温度处于55℃时，P接枝的玻璃基片表面完全处于一种疏水的状 态。由于蛋白质在60℃左右会开始热变性，因此在4～55℃实现目标物的捕 获，在＜4℃实现目标物的释放。

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本发明提供的太赫兹生物传感器的样本检测方法优选的包括以下步骤：

[0103](1)在微量进样泵的推动下，将浓度为0.1mg/ML的Bt基因蛋白液体 样本(缓冲液为HEPES，羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，推送到芯片通道中，2℃ 保持3min。[0104](2)使用太赫兹时域光谱系统，太赫兹光斑大小为2cm，照射微流盘 通道，获得样本的时域光谱数据。[0105](3)为了避免随机误差，时间间隔1min，测量5次时域光谱数据，取 平均值。[0106](4)将此微流芯片放置到55℃的加热板上保持3min，然后用HEPES (取2.383g HEPES溶于900mL的超纯水中，然后利用NaOH调节其pH值 到9.8，最后将其定容到1L)缓冲液冲洗通道2次，并最后用HEPES缓冲 液充满整个通道，为下次测量做准备。[0107]实验样本：

[0108]表2测试实验样本清单

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测试结果如图9所示，从实验测试结果可以看出，采用本发明的测试方 法，可以有

效的检测出Bt基因目标蛋白的棉种，每个棉种测试5次的检出 率为100％。[0111]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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图1

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图3

图4

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图5

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图6

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图8

图9

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