PCR方法?
发布网友
发布时间：2022-04-25 19:45
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热心网友
时间：2022-06-16 20:23
聚合酶链式反应，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DN*段。可看作生物体外的特殊DNA复制。
原理是DNA的半保留复制以及可以通过温度变化控制DNA的变性和复性。
参加PCR反应的物质主要有五种：
引物(PCR引物为DN*段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、Taq DNA聚合酶、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性
（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA
2.退火
（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
热心网友
时间：2022-06-16 20:24
我实验上常用的一个用Taq DNAPolymerase 的体系
一般的检测及扩增PCR可以如下
加样（单位：微升）：
1. 2×Taq Mix：7.5
2. 正向引物：0.5
3. 反向引物：0.5
4. 双蒸水：补到使体系为15微升为止
5. 模板：0.1-2
Program：
1.预变性 94℃ 4min
2.变性 94℃ 30s
3.退火 Tm值减5℃ 至7℃ 30s
4.延伸 72℃ 1kb/min goto 2,34cycles
5.终延伸 72℃ 10min
6.结束后样品保温 16℃ 保温
热心网友
时间：2022-06-16 20:24
聚合酶链式反应
